RT-LAMP ஃப்ளோரன்சென்ட் மாஸ்டர் மிக்ஸ்
இந்த தயாரிப்பில் ரியாக்ஷன் பஃபர், ஆர்டி-என்சைம்ஸ் மிக்ஸ் (பிஎஸ்டி டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் மற்றும் ஹீட்-ரெசிஸ்டண்ட் ரிவர்ஸ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ்), லியோஃபிலைஸ்டு ப்ரொடெக்டண்ட்ஸ் மற்றும்ஒளிரும்சாய கூறுகள்.எதிர்வினை தாங்கலில் Mg2+, dNTP மற்றும் பெருக்கத்திற்கு தேவையான பிற கூறுகள் உள்ளன.பயன்படுத்த, பஃபர், ரியாக்ஷன் என்சைம், ஃப்ளோரசன்ட் டை, ப்ரைமர் ஆகியவற்றைக் கலந்து டெம்ப்ளேட்டைச் சேர்க்கவும், லியோஃபிலைஸ் செய்யப்பட்ட ப்ரொடெக்டண்ட்டைச் சேர்த்து நேரடியாகப் பயன்படுத்தலாம்.இது ஒரு lyophilizer உடன் இணைக்கப்பட்டு lyophilized ஆனது, மேலும் பயன்படுத்தப்படும் போது ப்ரைமர்கள் மற்றும் வார்ப்புருக்கள் மட்டுமே சேர்க்கப்பட்டது.இந்த மறுஉருவாக்கம் அதிக பெருக்க திறன் மற்றும் உணர்திறன் கொண்டது.
கூறு
கூறு | HCB5205A-01 | HCB5205A-02 | HCB5205A-03 |
லூப்-மத்தியஸ்த பெருக்க இடையகம் | 1.2 மி.லி | 4 மிலி × 3 | 12 மிலி × 10 |
RT-என்சைம்கள் கலவை | 245 μL | 2.45 மி.லி | 2.45 மிலி×10 |
லியோபிலிஸ்டு பாதுகாப்பு | 0.96 மிலி×2 | 9.60 மிலி×2 | 9.60 மிலி×20 |
25× சாயம் | 192 μL | 0.96 மிலி×2 | 0.96 மிலி×20 |
விண்ணப்பங்கள்
டிஎன்ஏ அல்லது ஆர்என்ஏ சமவெப்ப பெருக்கத்திற்கு.
களஞ்சிய நிலைமை
உலர் பனியுடன் கொண்டு செல்லப்படுகிறது, -25~ -15℃ இல் சேமிக்கப்படுகிறது.அடிக்கடி உறைதல்-கரைப்பதைத் தவிர்க்கவும், தயாரிப்பு 12 மாதங்களுக்கு செல்லுபடியாகும்.
நெறிமுறை
1.அறை வெப்பநிலையில் பயன்படுத்தப்படும் எதிர்வினை இடையகத்தை கரைக்கவும்.சுருக்கமாக சுழல் அல்லது பலமுறை குழாய்களை கவிழ்த்து நன்கு கலக்கவும், பின்னர் மையவிலக்கு குழாயின் அடிப்பகுதிக்கு திரவத்தை சேகரிக்கவும்.
2.எதிர்வினை அமைப்பு தயாரித்தல்.இந்த மறுஉருவாக்கத்தை இரண்டு எதிர்வினை அமைப்புகளில் தயாரிக்கலாம், திரவ எதிர்வினை கலவை மற்றும் லியோபிலைஸ் செய்யப்பட்ட அமைப்பு கலவை.
1) திரவ எதிர்வினை கலவையை தயார் செய்யவும்
கூறு | தொகுதி |
லூப்-மத்தியஸ்த பெருக்க இடையகம் | 12.5 μL |
25× சாயம் | 2 μL |
RT-என்சைம்கள் கலவை | 2.55 μL |
10 × ப்ரைமர் மிக்ஸ்a | 5 μL |
வார்ப்புருக்கள் டிஎன்ஏ/ஆர்என்ஏ b | × μL |
அணுக்கரு இல்லாத நீர் | 50 μL வரை |
2) லியோபிலைசேஷன் அமைப்பு கலவை
① லியோஃபிலைஸ் செய்யப்பட்ட கலவையை தயார் செய்யவும்
கூறு | தொகுதி |
லூப்-மத்தியஸ்த பெருக்க இடையகம் | 12.5 μL |
லியோபிலிஸ்டு பாதுகாப்பு | 20 μL |
25× சாயம் | 2 μL |
RT-என்சைம்கள் கலவை | 2.55 μL |
அணுக்கரு இல்லாத நீர் | 50 μL வரை |
② லியோபிலைசேஷன்: தயாரிக்கப்பட்ட கலவை 50μL அமைப்பில் லியோபிலைஸ் செய்யப்பட்டது
③ எதிர்வினை கலவையை தயார் செய்யவும்
கூறு | தொகுதி |
லியோபிலைஸ் செய்யப்பட்ட கலவை | 1 துண்டு |
10 × ப்ரைமர் மிக்ஸ்a | 5 μL |
வார்ப்புருக்கள் டிஎன்ஏ/ஆர்என்ஏ b | × μL |
அணுக்கரு இல்லாத நீர் | 50 μL வரை |
குறிப்புகள்:
1) a.10×பிரைமர் கலவை : 16 μM FIP/BIP, 2 μM F3/B3, 4 μM லூப் F/B;
2) பி.DEPC (நீரில் கரையக்கூடியது) நியூக்ளிக் அமிலம் டெம்பலுக்கு பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.
3)பெருக்க எதிர்வினை: ஒளிரும் PCR கருவியில் பின்வரும் நிரலை அமைக்கவும் (எ.கா. ABI7500, முதலியன):
வெப்ப நிலை | நேரம் | வட்டங்கள் |
65℃ | 60 நொடி *FAM ஃப்ளோரசன்ஸை சேகரிக்கவும் | 30 |
குறிப்புகள்
1.இடையகக் குழாயின் அடிப்பகுதியில் உப்பு தோன்றலாம், சுருக்கமாக சுழலலாம் அல்லது அறை வெப்பநிலையில் நன்கு கலக்க குழாய்களை பல முறை தலைகீழாக மாற்றலாம்.
2.ப்ரைமர்களின் நிலைக்கு ஏற்ப எதிர்வினை வெப்பநிலையை 62 ℃ மற்றும் 68 ℃ வரை மேம்படுத்தலாம்.
3.எதிர்வினை அமைப்பு, லியோபிலைசேஷன் மற்றும் மாதிரி செயலாக்கம் மற்றும் மாதிரி சேர்க்கும் செயல்முறை ஆகியவற்றின் தயாரிப்பு உட்பட, சோதனை தரப்படுத்தப்பட வேண்டும்;
4.மாசுபடுவதைத் தவிர்ப்பதற்காக, தவறான நேர்மறை குறுக்கீடுகளைத் தவிர்க்க, மற்றவற்றில், வார்ப்புருவை அறையின் புகைப் பெட்டியில் சேர்ப்பது, ஒரு அதி-சுத்தமான பெஞ்சில் எதிர்வினை அமைப்பைத் தயாரிக்க பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.