எண்டோஃப்ரீ பிளாஸ்மிட் மேக்ஸி கிட்

பூனை எண்:HC1006B

தொகுப்பு:10RXN

தயாரிப்பு விளக்கம்

தயாரிப்பு விவரம்

இந்த கருவியானது 150 - 300 மில்லி பாக்டீரியா கரைசலில் இருந்து ஒரே இரவில் வளர்க்கப்பட்டு, மேம்படுத்தப்பட்ட SDS- அல்கலைன் லிசிஸ் முறையைப் பயன்படுத்தி பாக்டீரியாவை லைஸ் செய்ய ஏற்றது.கச்சா சாறு ஒரு தனித்துவமான எண்டோடாக்சின் ஸ்கேவெஞ்சருடன் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட முறையில் இணைக்கப்படுகிறது மற்றும் எண்டோடாக்சின்களை அகற்ற மையவிலக்கு மூலம் பிரிக்கப்படுகிறது.பின்னர், சிலிக்கா ஜெல் சவ்வு அதிக உப்பு மற்றும் குறைந்த pH நிலைமைகளின் கீழ் கரைசலில் உள்ள பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏவுடன் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட முறையில் பிணைக்கிறது.இதைத் தொடர்ந்து அசுத்தங்கள் மற்றும் பிற பாக்டீரியா கூறுகளை அகற்ற வாஷ் பஃபர் சேர்க்கப்படுகிறது.இறுதியாக, சிலிக்கான் மேட்ரிக்ஸ் மென்படலத்திலிருந்து தூய பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏவை வெளியேற்றுவதற்கு குறைந்த உப்பு, அதிக pH எலுஷன் பஃபர் பயன்படுத்தப்படுகிறது.சிலிக்கா ஜெல் சவ்வு சிறப்பு உறிஞ்சுதல் மென்படலத்தைப் பயன்படுத்துகிறது, மேலும் நெடுவரிசைக்கும் நெடுவரிசைக்கும் இடையிலான உறிஞ்சுதல் அளவு வேறுபாடு மிகச் சிறியது மற்றும் மீண்டும் மீண்டும் நன்றாக இருக்கும்.ஃபீனால், குளோரோஃபார்ம் மற்றும் பிற நச்சு எதிர்வினைகள் தேவையில்லை, மேலும் எத்தனால் மழைப் படிகளும் தேவையில்லை.80% -90% பிரித்தெடுக்கும் விகிதத்துடன், 0.2 -1.5 மில்லிகிராம் தூய உயர்-நகல் பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏவை விரைவாகப் பிரித்தெடுக்க இந்தக் கருவியைப் பயன்படுத்தலாம்.கிட் ஒரு தனித்துவமான செயல்முறை சூத்திரத்தைப் பயன்படுத்துகிறது, எண்டோடாக்சின் நீக்குகிறது, எண்டோடாக்சின் உள்ளடக்கம் மிகவும் குறைவாக உள்ளது மற்றும் செல் பரிமாற்ற விளைவு சிறப்பாக உள்ளது.பிரித்தெடுக்கப்பட்ட பிளாஸ்மிட் நேரடியாக என்சைம் செரிமானம், பிசிஆர், இன் விட்ரோ டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன், டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன், சீக்வென்சிங் மற்றும் பிற மூலக்கூறு உயிரியல் சோதனைகளில் பயன்படுத்தப்படலாம்.

முந்தைய: RT-LAMP கலர்மெட்ரிக் (Lyophilized ball) HCB5206A

அடுத்தது: டிஎன்ஏ பிரித்தெடுத்தல் மினி கிட் HC1007B

களஞ்சிய நிலைமை

RNaseA -30 ~ -15℃ இல் சேமிக்கப்பட்டு ≤0℃ இல் கொண்டு செல்லப்பட வேண்டும்.

எண்டோடாக்சின் ஸ்கேவெஞ்சரை ஒரு மாதத்திற்கு 2 ~ 8℃ இல் சேமிக்கலாம், நீண்ட கால சேமிப்பிற்காக -30 ~ -15℃ இல் சேமிக்கலாம்மற்றும் ≤0℃ இல் கொண்டு செல்லப்படுகிறது.

மற்ற கூறுகள் அறை வெப்பநிலையில் (15 ~25℃) சேமித்து அறை வெப்பநிலையில் கொண்டு செல்லப்பட வேண்டும்.

கூறுகள்

கூறுகள்	10RXNS
ஆர்.நேஸ் ஏ	750 μL
இடையக P1	75 மி.லி
பஃபர் பி2	75 மி.லி
இடையக P4	75 மி.லி
எண்டோடாக்சின் ஸ்கேவெஞ்சர்	25 மி.லி
தாங்கல் PW	2 × 22 மிலி
தாங்கல் TB	20 மி.லி
FastPure DNA Maxi Columns (ஒவ்வொன்றும் 50ml சேகரிப்பு குழாயில்)	10
எண்டோடாக்சின் இல்லாத சேகரிப்பு குழாய்	2 × 5

RNaseA:10 mg/ml, RNA ஐ அகற்ற பயன்படுகிறது.

இடையக P1:பாக்டீரியா சஸ்பென்ஷன் பஃபர், முதல் பயன்பாட்டிற்கு முன் RNaseA ஐ Buffer P1 உடன் சேர்க்கவும்.

இடையக P2:பாக்டீரியா சிதைவு தாங்கல் (SDS/NaOH கொண்டது).

இடையக P4:நடுநிலைப்படுத்தும் தாங்கல்.

எண்டோடாக்சின் ஸ்கேவெஞ்சர்:கச்சா பிளாஸ்மிட் சாற்றில் இருந்து எண்டோடாக்சினை திறம்பட நீக்குகிறது.

தாங்கல் PW:இடையகத்தை கழுவவும், முதல் பயன்பாட்டிற்கு முன் எத்தனாலின் நிர்ணயிக்கப்பட்ட அளவை சேர்க்கவும்.

தாங்கல் TB:நீக்குதல் தாங்கல்.

FastPure DNA Maxi பத்திகள்:பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏ உறிஞ்சுதல் பத்திகள்.

சேகரிப்பு குழாய்கள் 50 மிலி:வடிகட்டுதல் சேகரிப்பு குழாய்கள்.

எண்டோடாக்சின் இல்லாத சேகரிப்பு குழாய்:பிளாஸ்மிட் டிஎன்ஏ சேகரிப்பு குழாய்கள்.

தயாரிக்கப்பட்ட பொருட்கள்

முழுமையான எத்தனால், ஐசோப்ரோபனோல், 50 மில்லி வட்ட-கீழ் மையவிலக்கு குழாய்கள் மற்றும் 50 மில்லி எண்டோடாக்சின் இல்லாததுமையவிலக்கு குழாய்கள்.

விண்ணப்பங்கள்

இந்த தயாரிப்பு 150 - 300 மில்லி பாக்டீரியா கரைசலில் இருந்து பிளாஸ்மிட்களை பெரிய அளவில் பிரித்தெடுக்க ஏற்றது.ஒரே இரவில் கலாச்சாரம்.

பரிசோதனை செயல்முறை

1. 150 - 200 மில்லி (300 மில்லிக்கு மேல் இல்லை) பாக்டீரியா கரைசலை ஒரே இரவில் வளர்த்து, மையவிலக்கு1 - 2 நிமிடங்களுக்கு சுமார் 11,000 ஆர்பிஎம் (12,000 × கிராம்)சூப்பர்நேட்டன்ட்களை நிராகரித்து பாக்டீரியாவை சேகரிக்கவும்.

Δ 50 மில்லிக்கு மேல் பாக்டீரியா கரைசலை சேகரிக்கும் போது, பாக்டீரியா கரைசல், மையவிலக்கு, சூப்பர்நேட்டன்ட்டை அப்புறப்படுத்துதல் மற்றும் அதே 50 மில்லி குழாயில் மற்ற படிகளைச் சேர்ப்பதன் மூலம் பாக்டீரியாவை சேகரிக்கலாம்.

பல முறை.

2. 7.5 மிலி பஃபர் பி1 (ஆர்என்ஏஸ்ஏ பஃபர் பி1 இல் சேர்க்கப்பட்டுள்ளதா என சரிபார்க்கவும்) மையவிலக்குடன் சேர்க்கவும்பாக்டீரியாவைக் கொண்ட குழாய் மற்றும் சுழல் அல்லது குழாய் மூலம் நன்கு கலக்கவும்.

Δ இந்த கட்டத்தில் பாக்டீரியாவின் முழுமையான மறுசீரமைப்பு விளைச்சலுக்கு மிகவும் முக்கியமானது, மேலும் மறுசீரமைப்பிற்குப் பிறகு பாக்டீரியாக் கட்டிகள் இருக்கக்கூடாது.முழுமையாக கலக்கப்படாத பாக்டீரியாக் கட்டிகள் இருந்தால், அது சிதைவை பாதிக்கும், இதன் விளைவாக குறைந்த மகசூல் மற்றும் தூய்மை கிடைக்கும்.பாக்டீரியா கரைசலின் OD600 0.65 ஆக இருந்தால், 150 மில்லி பாக்டீரியா கரைசலில் இருந்து பிரித்தெடுக்கும் போது 7.5 மில்லி பஃபர் பி1 பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கப்படுகிறது;OD600 0.75 ஆக இருக்கும் போது, 8 மில்லி Buffer P1 ஐப் பயன்படுத்த வேண்டும் மற்றும் Buffers P2 மற்றும் P4 ஆகியவற்றின் தொகுதிகள் அதற்கேற்ப மாற்றப்பட வேண்டும்.பாக்டீரியா கரைசலின் அளவு 200 மில்லியாக அதிகரிக்கப்பட்டால், அது பரிந்துரைக்கப்படுகிறதுBuffers P1, P2 மற்றும் P4 ஆகியவற்றின் அளவு விகிதாசாரமாக அதிகரிக்கப்படும்.

3. ஸ்டெப் 2ல் இருந்து பாக்டீரியல் சஸ்பென்ஷனில் 7.5 மில்லி பஃபர் பி2 சேர்த்து 6 - 8 வரை மெதுவாக மேலும் கீழும் கலக்கவும்.முறை மற்றும் அறை வெப்பநிலையில் 4 - 5 நிமிடங்கள் அடைகாக்கவும்.

Δ முழுமையாக கலக்க மெதுவாக தலைகீழாக மாற்றவும்.சுழல் மரபணு டிஎன்ஏ சிதைவை ஏற்படுத்தும், இதன் விளைவாக பிரித்தெடுக்கப்பட்ட பிளாஸ்மிட்டில் மரபணு டிஎன்ஏ துண்டுகள் உருவாகின்றன.இந்த நேரத்தில், தீர்வு பிசுபிசுப்பு மற்றும் ஒளிஊடுருவக்கூடியதாக மாறும், இது பாக்டீரியா முழுவதுமாக லைஸ் செய்யப்பட்டுள்ளது என்பதைக் காட்டுகிறது.பிளாஸ்மிட்கள் அழிக்கப்படுவதைத் தவிர்க்க, கால அளவு 5 நிமிடங்களுக்கு மேல் இருக்கக்கூடாது.தீர்வு தெளிவாக இல்லை என்றால், அதன் விளைவாக பல பாக்டீரியாக்கள் இருக்கலாம்முழுமையற்ற சிதைவு, எனவே பாக்டீரியாவின் அளவை சரியான முறையில் குறைக்க வேண்டும்.

4. ஸ்டெப் 3ல் இருந்து பாக்டீரியல் சஸ்பென்ஷனில் 7.5 மிலி பஃபர் பி4ஐ சேர்த்து உடனடியாக 6 - 8 முறை மெதுவாக தலைகீழாக மாற்றவும்.இந்த நேரத்தில், வெள்ளை flocculent வீழ்படிவு தோன்ற வேண்டும்.10 - 15 நிமிடங்களுக்கு சுமார் 11,000 rpm (12,000 × g) க்கு மேல் மையவிலக்கு, ஒரு புதிய 50 மில்லி வட்ட-கீழே மையவிலக்குக் குழாயில் (சுயமாக தயாரிக்கப்பட்டது) சூப்பர்நேட்டன்ட்டை கவனமாக பைப்பட் செய்து, தவிர்க்கவும்மிதக்கும் வெள்ளை வீழ்படிவை விரும்பு.

Δ Buffer P4 ஐச் சேர்த்து நன்கு கலக்க உடனடியாக தலைகீழாக மாற்றவும்.நடுநிலைப்படுத்தலைப் பாதிக்கக்கூடிய உள்ளூர் மழைப்பொழிவைத் தடுக்க, தீர்வு முழுவதும் வெள்ளை படிவு சமமாக விநியோகிக்கப்படும் வரை குழாயை நிற்க விடவும்.மையவிலக்குக்கு முன் சீரான வெள்ளை ஃப்ளோக்குலண்ட் படிவு இல்லாமலும், மையவிலக்குக்குப் பிறகு சூப்பர்நேட்டன்ட் தெளிவாக இல்லாமலும் இருந்தால், குழாய்மற்றொரு 5 நிமிடங்களுக்கு மையவிலக்கு.

5. எண்டோடாக்சின் ஸ்கேவெஞ்சரின் அளவை 0. 1 மடங்கு (மேற்பரப்பு அளவின் 10%, சுமார் 2.2 மில்லி) படி 4-ல் இருந்து சூப்பர்நேட்டண்டில் சேர்த்து கலக்கவும்.கரைசலை ஒரு ஐஸ் குளியலில் வைக்கவும் அல்லது நொறுக்கப்பட்ட பனியில் (அல்லது குளிர்சாதன பெட்டி உறைவிப்பான்) 5 நிமிடங்களுக்கு தீர்வு கொந்தளிப்பிலிருந்து தெளிவான மற்றும் வெளிப்படையானதாக மாறும் வரை (அல்லது இன்னும்சிறிது கொந்தளிப்பானது), மற்றும் எப்போதாவது பல முறை கலக்கவும்.

Δ எண்டோடாக்சின் ஸ்கேவெஞ்சர் சூப்பர்நேட்டண்டில் சேர்க்கப்பட்ட பிறகு, சூப்பர்நேட்டன்ட் கொந்தளிப்பாக மாறும், ஆனால்ஐஸ் குளியலில் குளிர்ந்த பிறகு சூப்பர்நேட்டண்ட் தெளிவாக (அல்லது சற்று கொந்தளிப்பாக) மாற வேண்டும்.

6. சூப்பர்நேட்டன்ட் அறை வெப்பநிலையில் (>25℃) 10 - 15 நிமிடங்களுக்கு வைக்கப்பட்ட பிறகு, அது கொந்தளிப்பாக மாறும்அதன் வெப்பநிலை அறை வெப்பநிலைக்கு அதிகரிக்கிறது.பிறகு சூப்பர்நேட்டன்ட் தலைகீழாக கலக்கப்பட வேண்டும்.

Δ அறை வெப்பநிலை குறைவாக இருந்தால் அல்லது நீங்கள் பிரித்தெடுக்கும் நேரத்தை குறைக்க விரும்பினால், சூப்பர்நேட்டன்ட்டை 37 ~ 42 ℃ நீர் குளியல் ஒன்றில் 5 - 10 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கலாம், மேலும் அடுத்த கட்டத்தை சூப்பர்நேட்டன்ட் பிறகு மேற்கொள்ளலாம்.கொந்தளிப்பாகிறது.

7. கட்டத்தை பிரிக்க அறை வெப்பநிலையில் (வெப்பநிலை >25℃) 10 நிமிடங்களுக்கு சுமார் 11,000 rpm (12,000 × g) இல் அதிவேகத்தை மையவிலக்கு செய்யவும்.மேல் அக்வஸ் கட்டத்தில் டிஎன்ஏ உள்ளது, அதே சமயம் கீழ் நீல எண்ணெய் கட்ட அடுக்கில் எண்டோடாக்சின் மற்றும் பிற அசுத்தங்கள் உள்ளன.இடமாற்றம்டிஎன்ஏ-உள்ள நீர்நிலை ஒரு புதிய குழாய் மற்றும்எண்ணெய் அடுக்கை நிராகரிக்கவும்.

Δ மையவிலக்கலின் போது வெப்பநிலை 25℃க்கு மேல் இருக்க வேண்டும், ஏனெனில் பயனுள்ள கட்டப் பிரிப்பு இல்லைவெப்பநிலை மிகவும் குறைவாக இருந்தால் ஏற்படும்.

Δ கட்டப் பிரிப்பு பயனுள்ளதாக இல்லை என்றால், மையவிலக்கு வெப்பநிலையை 30℃ மற்றும்மையவிலக்கு நேரத்தை 15 நிமிடங்களாக அதிகரிக்கலாம்.

Δ எண்டோடாக்சின் மற்றும் பிற அசுத்தங்களைக் கொண்டிருப்பதால், நீல எண்ணெய் அடுக்குகளை உறிஞ்ச வேண்டாம்.

பொறிமுறை

மறுசீரமைப்பு லிசிஸ் நடுநிலைப்படுத்தல்

◇ 7.5 மிலி பஃபர் பி1 சேர்க்கவும்

◇ 7.5 மிலி பஃபர் பி2 சேர்க்கவும்

◇ 7.5 மிலி பஃபர் பி4 சேர்க்கவும்

எண்டோடாக்சின் நீக்கம்

◇எண்டோடாக்சின் ஸ்காவெஞ்சரின் சூப்பர்நேட்டன்ட் அளவை விட 0. 1 மடங்கு சேர்க்கவும்

பிணைத்தல் மற்றும் கழுவுதல்

◇ ஐசோப்ரோபனோலின் அளவை விட 0.5 மடங்கு சேர்க்கவும்