Rnase தடுப்பான்
முரைன் ஆர்நேஸ் இன்ஹிபிட்டர் என்பது ஈ.கோலியிலிருந்து வெளிப்படுத்தப்பட்டு சுத்திகரிக்கப்பட்ட ஒரு மறுசீரமைப்பு முரைன் ஆர்நேஸ் தடுப்பானாகும்.இது கோவலன்ட் அல்லாத பிணைப்பின் மூலம் 1:1 விகிதத்தில் RNase A, B அல்லது C உடன் பிணைக்கிறது, இதன்மூலம் மூன்று நொதிகளின் செயல்பாட்டைத் தடுக்கிறது மற்றும் RNA சிதைவதிலிருந்து பாதுகாக்கிறது.இருப்பினும், இது RNase 1, RNase T1, S1 நியூக்லீஸ், RNase H அல்லது Aspergillus இலிருந்து RNase க்கு எதிராக செயல்படாது.முரின் RNase இன்ஹிபிட்டர் RT-PCR, RT-qPCR மற்றும் IVT mRNA ஆல் சோதிக்கப்பட்டது, மேலும் இது பல்வேறு வணிகரீதியான தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்டேஸ்கள், DNA பாலிமரேஸ்கள் மற்றும் RNA பாலிமரேஸ்கள் ஆகியவற்றுடன் இணக்கமாக இருந்தது.
மனித RNase தடுப்பான்களுடன் ஒப்பிடும்போது, முரைன் RNase தடுப்பானில் இரண்டு சிஸ்டைன்கள் இல்லை, அவை ஆக்ஸிஜனேற்றத்திற்கு அதிக உணர்திறன் கொண்டவை, இது தடுப்பானை செயலிழக்கச் செய்கிறது.இது DTTயின் குறைந்த செறிவுகளில் (1 mM க்கும் குறைவானது) நிலையானதாக ஆக்குகிறது.இந்த அம்சம் டிடிடியின் அதிக செறிவுகள் எதிர்வினைக்கு பாதகமான எதிர்வினைகளில் பயன்படுத்துவதற்கு ஏற்றதாக ஆக்குகிறது (எ.கா. நிகழ்நேர RT-PCR).
Aவிண்ணப்பம்
ஆர்என்ஏ சிதைவைத் தவிர்க்க RNase குறுக்கீடு சாத்தியமான எந்தவொரு பரிசோதனையிலும் இந்தத் தயாரிப்பு பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படலாம், அதாவது:
1.சிடிஎன்ஏ, ஆர்டி-பிசிஆர், ஆர்டி-க்யூபிசிஆர் போன்றவற்றின் முதல் இழையின் தொகுப்பு.
2.விட்ரோ டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன்/மொழிபெயர்ப்பின் போது (எ.கா. இன் விட்ரோ வைரஸ் ரெப்ளிகேஷன் சிஸ்டம்) சிதைவதிலிருந்து ஆர்என்ஏவைப் பாதுகாக்கிறது.
3.ஆர்என்ஏ பிரித்தல் மற்றும் சுத்திகரிப்பு போது RNase செயல்பாடு தடுப்பு.
களஞ்சிய நிலைமை
தயாரிப்பு -25～- 15 ℃ இல் சேமிக்கப்படும், 2 ஆண்டுகளுக்கு செல்லுபடியாகும்.
சேமிப்பு தாங்கல்
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.6, 25 ℃), 8 mM DTT மற்றும் 50% கிளிசரால்.
அலகு வரையறை
5ng ribonuclease A இன் செயல்பாட்டை 50% தடுக்கத் தேவையான murine RNase இன்ஹிபிட்டரின் அளவு ஒரு அலகு (U) என வரையறுக்கப்பட்டது.
புரதத்தின் மூலக்கூறு எடை
முரைன் RNase தடுப்பானின் மூலக்கூறு எடை 50 kDa ஆகும்.
தர கட்டுப்பாடு
Exonuclease செயல்பாடு:
16 மணி நேரத்திற்கு 37℃ இல் 1 μg λ -ஹிண்ட் III ஜீரண DNA உடன் 40 U முரைன் RNase தடுப்பானானது அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மூலம் தீர்மானிக்கப்படும் சிதைவை அளிக்காது.
எண்டோநியூக்லீஸ் செயல்பாடு:
40 U முரைன் RNase இன்ஹிபிட்டர் 1μg λ DNA உடன் 37℃ 16 மணிநேரத்திற்கு agarose ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மூலம் தீர்மானிக்கப்படும் சிதைவை அளிக்காது.
நிக்கிங் செயல்பாடு:
40U முரைன் RNase இன்ஹிபிட்டர் 1μg pBR322 உடன் 37℃ 16 மணிநேரத்திற்கு agarose ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மூலம் தீர்மானிக்கப்படும் சிதைவை அளிக்காது.
RNase செயல்பாடு:
40U முரைன் RNase இன்ஹிபிட்டர் 1.6μg MS2 RNA உடன் 4hக்கு 37℃ இல் agarose ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மூலம் தீர்மானிக்கப்படும் சிதைவை அளிக்காது.
E.கோலை டிஎன்ஏ:
E. coli 16S rRNA லோக்கஸுக்குக் குறிப்பிட்ட ப்ரைமர்களுடன் TaqMan qPCR ஐப் பயன்படுத்தி 40 U முரைன் RNase இன்ஹிபிட்டர் E. coli genomic DNA இருப்பதைத் திரையிடுகிறது.E. coli மரபணு DNA மாசுபாடு ≤ 0.1 pg/40 U.
Nஓட்டேs
1.வன்முறையான அலைவு அல்லது கிளறல் நொதி செயலிழக்க வழிவகுக்கும்.
2.இந்த தடுப்பானின் உகந்த வெப்பநிலை வரம்பு 25-55 ℃ ஆகும், மேலும் இது 65℃ மற்றும் அதற்கு மேல் செயலிழக்கப்பட்டது.
3. RNase H, RNase 1 மற்றும் RNase T1 ஆகியவற்றின் செயல்பாடுகள் முரைன் RNase இன்ஹிபிட்டரால் தடுக்கப்படவில்லை.
4. RNase செயல்பாட்டின் தடுப்பு பரந்த அளவிலான pH இல் கண்டறியப்பட்டது (pH 5-9 அனைத்தும் செயலில் இருந்தன), மேலும் அதிகபட்ச செயல்பாடு pH 7-8 இல் காணப்பட்டது.
5. ரைபோநியூக்லீஸ்கள் பொதுவாக டினாட்டரிங் நிலைமைகளின் கீழ் செயல்பாட்டைத் தக்கவைத்துக்கொள்வதால், ரிபோநியூக்லீஸுடன் சிக்கலான RNase இன்ஹிபிட்டர் மூலக்கூறுகளை நீக்குவதைத் தவிர்க்க கவனமாக இருக்க வேண்டும்.செயலில் உள்ள ரிபோநியூக்லீஸின் வெளியீட்டைத் தடுக்க, 50 °C க்கும் அதிகமான வெப்பநிலை மற்றும் அதிக செறிவு கொண்ட யூரியா அல்லது பிற டினாட்டரிங் முகவர்கள் தவிர்க்கப்பட வேண்டும்.
