மவுஸ் ஜெனோடைப்பிங் கிட்
பூனை எண்: HCR2021A
இந்த தயாரிப்பு டிஎன்ஏ கச்சா பிரித்தெடுத்தல் மற்றும் பிசிஆர் பெருக்க அமைப்பு உட்பட மவுஸ் மரபணு வகைகளை விரைவாக அடையாளம் காண வடிவமைக்கப்பட்ட கிட் ஆகும்.Lysis Buffer மற்றும் Proteinase k மூலம் எளிய பிளவுகளுக்குப் பிறகு மவுஸ் டெயில், காது, கால் மற்றும் பிற திசுக்களில் இருந்து நேரடியாக PCR பெருக்கத்திற்கு தயாரிப்பு பயன்படுத்தப்படலாம்.ஒரே இரவில் செரிமானம் இல்லை, பீனால்-குளோரோஃபார்ம் பிரித்தெடுத்தல் அல்லது நெடுவரிசை சுத்திகரிப்பு, இது எளிமையானது மற்றும் சோதனைகளின் நேரத்தை குறைக்கிறது.தயாரிப்பு 2kb வரை இலக்கு துண்டுகளை பெருக்குவதற்கும், 3 ஜோடி ப்ரைமர்களுடன் கூடிய மல்டிபிளக்ஸ் PCR எதிர்வினைகளுக்கும் ஏற்றது.2×சுட்டி திசு நேரடி PCR கலவையில் மரபணு ரீதியாக வடிவமைக்கப்பட்ட DNA பாலிமரேஸ், Mg உள்ளது2+, dNTP கள் மற்றும் உயர் பெருக்க திறன் மற்றும் தடுப்பான் சகிப்புத்தன்மையை வழங்குவதற்கான உகந்த இடையக அமைப்பு, இதனால் PCR எதிர்வினைகளை டெம்ப்ளேட் மற்றும் ப்ரைமர்களைச் சேர்ப்பதன் மூலமும், தயாரிப்பை 1×க்கு ரீஹைட்ரேட் செய்வதன் மூலமும் மேற்கொள்ள முடியும்.இந்தத் தயாரிப்பின் மூலம் பெருக்கப்பட்ட PCR தயாரிப்பு 3′ இறுதியில் ஒரு முக்கிய "A" தளத்தைக் கொண்டுள்ளது மற்றும் சுத்திகரிக்கப்பட்ட பிறகு TA குளோனிங்கிற்கு நேரடியாகப் பயன்படுத்தலாம்.
கூறுகள்
| கூறு | அளவு |
| 2×சுட்டி திசு நேரடி PCR கலவை | 5×1.0மிலி |
| லிசிஸ் பஃபர் | 2×20மிலி |
| புரோட்டீனேஸ் கே | 800μL |
களஞ்சிய நிலைமை
தயாரிப்புகள் 2 ஆண்டுகளுக்கு -25~-15℃ இல் சேமிக்கப்பட வேண்டும்.கரைந்த பிறகு, லைசிஸ் பஃபர் குறுகிய கால பல பயன்பாட்டிற்காக 2~8℃ இல் சேமிக்கப்படும், மேலும் பயன்படுத்தும் போது நன்கு கலக்கவும்.
விண்ணப்பம்
இந்த தயாரிப்பு மவுஸ் நாக் அவுட் பகுப்பாய்வு, டிரான்ஸ்ஜெனிக் கண்டறிதல், மரபணு வகை மற்றும் பலவற்றிற்கு ஏற்றது.
அம்சங்கள்
1.எளிய செயல்பாடு: மரபணு டிஎன்ஏவை பிரித்தெடுக்க வேண்டிய அவசியமில்லை;
2.பரந்த பயன்பாடு: பல்வேறு சுட்டி திசுக்களின் நேரடி பெருக்கத்திற்கு ஏற்றது.
வழிமுறைகள்
1.மரபணு DNA வெளியீடு
1) லைசேட் தயாரித்தல்
லைஸ் செய்யப்பட வேண்டிய சுட்டி மாதிரிகளின் எண்ணிக்கைக்கு ஏற்ப டிஷ்யூ லைசேட் தயாரிக்கப்படுகிறது (திசு லைசேட் மருந்தின் படி தளத்தில் தயாரிக்கப்பட்டு பயன்படுத்துவதற்கு நன்கு கலக்கப்பட வேண்டும்), மேலும் ஒரு மாதிரிக்கு தேவையான எதிர்வினைகளின் விகிதம் பின்வருமாறு:
| கூறுகள் | தொகுதி (μL) |
| புரோட்டீனேஸ் கே | 4 |
| லிசிஸ் பஃபர் | 200 |
2) மாதிரி தயாரிப்பு மற்றும் லைசிஸ்
பரிந்துரைக்கப்பட்ட திசு பயன்பாடு
| வகைதிசு | பரிந்துரைக்கப்பட்ட தொகுதி |
| சுட்டி வால் | 1-3மிமீ |
| சுட்டி காது | 2-5மிமீ |
| சுட்டி கால்விரல் | 1-2 துண்டுகள் |
சுத்தமான மையவிலக்கு குழாய்களில் பொருத்தமான அளவு சுட்டி திசு மாதிரிகளை எடுத்து, ஒவ்வொரு மையவிலக்குக் குழாயிலும் 200μL புதிய திசு லைசேட்டைச் சேர்த்து, சுழலி மற்றும் குலுக்கி, பின்னர் 55℃ இல் 30 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கவும், பின்னர் 98℃ இல் 3 நிமிடங்களுக்கு சூடுபடுத்தவும்.
3) மையவிலக்கு
லைசேட்டை நன்றாக அசைத்து, 5 நிமிடங்களுக்கு 12,000 ஆர்பிஎம்மில் மையவிலக்கு.பிசிஆர் பெருக்கத்திற்கான டெம்ப்ளேட்டாக சூப்பர்நேட்டன்ட் பயன்படுத்தப்படலாம்.சேமிப்பிற்கு டெம்ப்ளேட் தேவைப்பட்டால், சூப்பர்நேட்டன்ட்டை மற்றொரு மலட்டு மையவிலக்குக் குழாய்க்கு மாற்றி -20℃ இல் 2 வாரங்களுக்கு சேமிக்கவும்.
2.பிசிஆர் பெருக்கம்
-20℃ இலிருந்து 2×மவுஸ் டிஷ்யூ டைரக்ட் பிசிஆர் கலவையை அகற்றி ஐஸ் மீது கரைத்து, தலைகீழாக கலந்து பிசிஆர் எதிர்வினை அமைப்பை பின்வரும் அட்டவணையின்படி தயார் செய்யவும் (ஐஸ் மீது இயக்கவும்):
| கூறுகள் | 25μLஅமைப்பு | 50μLஅமைப்பு | இறுதி செறிவு |
| 2×சுட்டி திசு நேரடி PCR கலவை | 12.5μL | 25μL | 1× |
| ப்ரைமர் 1 (10μM) | 1.0μL | 2.0μL | 0.4μM |
| ப்ரைமர் 2 (10μM) | 1.0μL | 2.0μL | 0.4μM |
| பிளவு தயாரிப்புa | தேவைக்கேற்ப | தேவைக்கேற்ப |
|
| ddH2O | 25μL வரை | 50μL வரை |
|
குறிப்பு:
a) சேர்க்கப்பட்ட தொகையானது அமைப்பின் 1/10 ஐ விட அதிகமாக இருக்கக்கூடாது, மேலும் அதிகமாக சேர்க்கப்பட்டால், PCR பெருக்கம் தடுக்கப்படலாம்.
பரிந்துரைக்கப்பட்ட PCR நிபந்தனைகள்
| சுழற்சி படி | வெப்பநிலை | நேரம் | சுழற்சிகள் |
| ஆரம்ப நிலைமாற்றம் | 94℃ | 5 நிமிடங்கள் | 1 |
| டினாடரேஷன் | 94℃ | 30 வினாடிகள் | 35-40 |
| அனீலிங்a | Tm+3~5℃ | 30 வினாடிகள் | |
| நீட்டிப்பு | 72℃ | 30 நொடி/கி.பி | |
| இறுதி நீட்டிப்பு | 72℃ | 5 நிமிடங்கள் | 1 |
| - | 4℃ | பிடி | - |
குறிப்பு:
அ) அனீலிங் வெப்பநிலை: ப்ரைமரின் Tm மதிப்பைக் கொண்டு, அனீலிங் வெப்பநிலையை ப்ரைமரின் சிறிய Tm மதிப்புக்கு அமைக்க பரிந்துரைக்கப்படுகிறது +3~5℃.
பொதுவான பிரச்சனைகள் மற்றும் தீர்வுகள்
1.இலக்கு பட்டைகள் இல்லை
1) அதிகப்படியான லிசிஸ் தயாரிப்பு.வார்ப்புருவின் மிகவும் பொருத்தமான அளவைத் தேர்வுசெய்யவும், பொதுவாக கணினியின் 1/10 க்கு மேல் இல்லை;
2) மிகப் பெரிய மாதிரி அளவு.லைசேட்டை 10 முறை நீர்த்துப்போகச் செய்து, பிறகு பெருக்கவும் அல்லது மாதிரி அளவைக் குறைக்கவும் மற்றும் மறு-லிசிஸ் செய்யவும்;
3) திசு மாதிரிகள் புதியவை அல்ல.புதிய திசு மாதிரிகளைப் பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கப்படுகிறது;
4) மோசமான ப்ரைமர் தரம்.ப்ரைமர் தரத்தை சரிபார்க்கவும், ப்ரைமர் வடிவமைப்பை மேம்படுத்தவும் பெருக்க மரபணு டிஎன்ஏவைப் பயன்படுத்தவும்.
2.குறிப்பிடப்படாத பெருக்கம்
1) அனீலிங் வெப்பநிலை மிகவும் குறைவாக உள்ளது மற்றும் சுழற்சி எண் மிக அதிகமாக உள்ளது.அனீலிங் வெப்பநிலையை அதிகரிக்கவும் மற்றும் சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கையை குறைக்கவும்;
2) டெம்ப்ளேட் செறிவு மிக அதிகமாக உள்ளது.டெம்ப்ளேட்டின் அளவைக் குறைக்கவும் அல்லது பெருக்கத்திற்குப் பிறகு 10 முறை டெம்ப்ளேட்டை நீர்த்துப்போகச் செய்யவும்;
3) மோசமான ப்ரைமர் விவரக்குறிப்பு.ப்ரைமர் வடிவமைப்பை மேம்படுத்தவும்.
குறிப்புகள்
1.மாதிரிகளுக்கு இடையே குறுக்கு மாசுபடுவதைத் தவிர்க்க, பல மாதிரி கருவிகள் தயாரிக்கப்பட வேண்டும், மேலும் மீண்டும் மீண்டும் பயன்படுத்தினால், ஒவ்வொரு மாதிரிக்குப் பிறகும் கருவிகளின் மேற்பரப்பை 2% சோடியம் ஹைபோகுளோரைட் கரைசல் அல்லது நியூக்ளிக் அமிலம் கிளீனர் மூலம் சுத்தம் செய்யலாம்.
2.புதிய மவுஸ் திசுக்களைப் பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கப்படுகிறது, மேலும் பெருக்க முடிவுகளை பாதிக்காமல் இருக்க மாதிரி அளவு அதிகமாக இருக்கக்கூடாது.
3.லைசிஸ் பஃபர் அடிக்கடி உறைதல்-கரைப்பதைத் தவிர்க்க வேண்டும், மேலும் குறுகிய கால பல பயன்பாட்டிற்காக 2~8℃ இல் சேமிக்கலாம்.குறைந்த வெப்பநிலையில் சேமிக்கப்பட்டால், மழைப்பொழிவு ஏற்படலாம், மேலும் பயன்படுத்துவதற்கு முன்பு முழுமையாகக் கரைக்கப்பட வேண்டும்.
4.PCR கலவை அடிக்கடி உறைதல்-கரைப்பதைத் தவிர்க்க வேண்டும், மேலும் குறுகிய காலத்திற்கு மீண்டும் மீண்டும் பயன்படுத்துவதற்கு 4℃ இல் சேமிக்கலாம்.
5.இந்த தயாரிப்பு விஞ்ஞான பரிசோதனை ஆராய்ச்சிக்காக மட்டுமே மற்றும் மருத்துவ நோயறிதல் அல்லது சிகிச்சையில் பயன்படுத்தப்படக்கூடாது.
