நேரடி PCR கிட் நடவும்
பூனை எண்: HCR2020A
தாவர நேரடி PCR கிட் தாவர இலைகள், விதைகள் போன்றவற்றை நேரடியாகப் பெருக்குவதற்கு ஏற்றது, மேலும் பாலிசாக்கரைடுகள் மற்றும் பாலிபினால்கள் இல்லாத தாவர மாதிரிகளின் உயர்-செயல்திறன் திரையிடலுக்குப் பயன்படுத்தலாம்.இயக்கிய பரிணாமத்தை அடிப்படையாகக் கொண்ட நேரடி பெருக்க டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ், தாவரங்களில் உள்ள PCR தடுப்பான்களுக்கு சிறந்த சகிப்புத்தன்மையைக் கொண்டுள்ளது.இதற்கிடையில், இது உயர் பெருக்க செயல்திறனை பராமரிக்கிறது, இது 5 kb க்குள் DNA துண்டுகளை பெருக்குவதற்கு ஏற்றது.புதிய அல்லது உறைந்த தாவர திசுக்களை லைஸ் செய்ய கிட்டில் உள்ள தனித்துவமான லிசிஸ் பஃபர் ஏ பயன்படுத்தப்படலாம்.இது செயல்பட எளிதானது மற்றும் லைசேட் சுத்திகரிப்பு இல்லாமல் பெருக்கத்திற்கான டெம்ப்ளேட்டாக பயன்படுத்தப்படலாம்.கச்சா மாதிரிகள் மீண்டும் மீண்டும் உறைதல் மற்றும் உருகிய பிறகு திறம்பட பெருக்க உதவும் பாதுகாப்பு முகவர்கள் இந்த அமைப்பில் உள்ளன.2 × பிளாண்ட் டைரக்ட் மாஸ்டர் மிக்ஸானது, பெருக்க வினையைச் செய்ய, ப்ரைமர்கள் மற்றும் டெம்ப்ளேட்களைச் சேர்க்க வேண்டும், இதன் மூலம் பைப்பெட்டிங் செயல்பாடுகளைக் குறைக்கிறது மற்றும் கண்டறிதல் செயல்திறன் மற்றும் முடிவுகளின் மறுஉருவாக்கம் ஆகியவற்றை மேம்படுத்துகிறது.
கூறுகள்
| கூறுகள் | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × தாவர நேரடி மாஸ்டர் கலவை | 1.25 மி.லி | 4×1.25 மிலி |
| தாவர நேரடி லைசிஸ் பஃபர் ஏ | 5 மி.லி | 20 மி.லி |
| தாவர நேரடி லைசிஸ் பஃபர் பி* | 5 மி.லி | 20 மி.லி |
*பிளான்ட் டைரக்ட் லைசிஸ் பஃபர் பி என்பது ஒரு விருப்பமான மறுஉருவாக்கமாகும், இது மாதிரிகளின் சேமிப்பு நேரத்தை நீடிப்பதற்காக தாவர நேரடி லைசிஸ் பஃபர் A ஐ நடுநிலையாக்கப் பயன்படுகிறது.இது உண்மையான சூழ்நிலைக்கு ஏற்ப பயன்படுத்தப்படலாம்.
களஞ்சிய நிலைமை
2 × பிளாண்ட் டைரக்ட் மாஸ்டர் மிக்ஸ், -30 ~ -15℃ இல் சேமித்து, மீண்டும் மீண்டும் உறைதல் மற்றும் கரைவதைத் தவிர்க்கவும்;தாவர நேரடி லைசிஸ் பஃபர், -30 ~ -15℃ அல்லது 2 ~ 8℃ இல் சேமிக்கவும்.
பரிசோதனை செயல்முறை
மாதிரி செயலாக்கம்–தாவர இலை
நேரடி முறை:இளம் இலைகளைப் பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.ஒரு சிறிய மற்றும் சீரான மாதிரியைப் பெற, 0.5 - 3 மிமீ நிலையான விட்டம் கொண்ட துளை பஞ்சைப் பயன்படுத்தவும், பின்னர் நேரடியாக PCR அமைப்பில் மாதிரியைச் சேர்க்கவும் (50 μl அமைப்பு பரிந்துரைக்கப்படுகிறது).குறிப்பு, மாதிரி PCR கரைசலில் இருப்பதையும், குழாய் சுவருக்கு எதிராக இல்லாமல் இருப்பதையும் உறுதிசெய்யவும்.நீண்ட துண்டுகள் மற்றும் சிக்கலான மாதிரிகளைப் பெருக்க நேரடி PCR பயன்படுத்தப்பட்டால், சிறிய விட்டம் (0.5 - 1 மிமீ) கொண்ட மாதிரியை டெம்ப்ளேட்டாகப் பயன்படுத்துவது சிறந்த முடிவுகளைப் பெற உதவும்.
அரைக்கும் லிசிஸ் முறை:இளம் இலைகளைப் பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.ஒரு சிறிய துண்டு இலையை (சுமார் 1 - 3 மிமீ விட்டம்) எடுத்து, அதை 20 μl பிளாண்ட் டைரக்ட் லைசிஸ் பஃபர் ஏபியில் வைத்து, முடிந்தவரை அரைக்கவும் (இந்த படிநிலையை 100 μl பைப்பட் நுனியில் இலையை அழுத்துவதன் மூலம் செய்யலாம். மாதிரி பிசைவதற்கு) .இலை திசுக்களின் பெரிய அளவுகள் பயன்படுத்தப்பட்டால் (7 மிமீக்கு மேல் இல்லை), நீர்த்த இடையகத்தின் அளவை 50 μl ஆக அதிகரிக்கவும்.இலைகள் அரைத்த பிறகு, தீர்வு பச்சை நிறத்தில் தோன்ற வேண்டும்.சுருக்கமான மையவிலக்குக்குப் பிறகு, பிசிஆர் அமைப்பில் 1 μl சூப்பர்நேட்டன்ட்டை எதிர்வினை டெம்ப்ளேட்டாகச் சேர்க்கவும்.
வெப்ப சிதைவு முறை:இளம் இலைகளைப் பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.ஒரு சிறிய துண்டு இலையை (சுமார் 1 - 3 மிமீ விட்டம்) எடுத்து, அதை 20 μl பிளாண்ட் டைரக்ட் லைசிஸ் பஃபர் ஏவில் வைத்து, 95 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் 5 - 10 நிமிடம் சூடாக்கவும்.லைஸ் செய்ய கடினமாக இருக்கும் இலைகளுக்கு (20 நிமிடங்களுக்கு மிகாமல்) சிதைவு நேரத்தை சரியான முறையில் நீட்டிக்க முடியும்.இலை திசுக்களின் பெரிய அளவுகள் பயன்படுத்தப்பட்டால் (7 மிமீக்கு மேல் இல்லை), நீர்த்த இடையகத்தின் அளவை 50 μl ஆக அதிகரிக்கவும்.சூடாக்கிய பிறகு, சுருக்கமாக மையவிலக்கு செய்து, பிசிஆர் அமைப்பில் 1 μl சூப்பர்நேட்டன்ட்டை எதிர்வினை டெம்ப்ளேட்டாகச் சேர்க்கவும்.
மாதிரி செயலாக்கம்- தாவர விதை
அரைக்கும் லிசிஸ் முறை:5 மிமீ விட்டம் கொண்ட விதைகளை வெட்டுவதற்கு ஸ்கால்பெல்லைப் பயன்படுத்தவும், அவற்றை 100 μl தாவர நேரடி லைசிஸ் பஃபர் ஏ உடன் சேர்த்து, மாதிரியை ஒரு பைப்பட் முனை அல்லது பிற கருவிகளைக் கொண்டு அரைக்கவும்.சுருக்கமாக சுழல் மற்றும் அறை வெப்பநிலையில் 3 - 5 நிமிடங்கள் நிற்கட்டும்.விதை மாதிரி நீர்த்த பஃப்பரில் மூழ்கியிருப்பதை உறுதி செய்து கொள்ளவும்.சுருக்கமான மையவிலக்குக்குப் பிறகு, பிசிஆர் அமைப்பில் 1 μl சூப்பர்நேட்டன்ட்டை எதிர்வினை டெம்ப்ளேட்டாகச் சேர்க்கவும்.
வெப்ப சிதைவு முறை:5 மிமீ விட்டம் கொண்ட விதைகளை வெட்டுவதற்கு ஸ்கால்பெல்லைப் பயன்படுத்தவும், அவற்றை 100 μl தாவர நேரடி லைசிஸ் பஃபர் ஏ உடன் சேர்த்து, 95 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் 5 - 10 நிமிடங்களுக்கு சூடாக்கவும்.லைஸ் செய்ய கடினமாக இருக்கும் இலைகளுக்கு (30 நிமிடங்களுக்கு மிகாமல்) சிதைவு நேரத்தை சரியான முறையில் நீட்டிக்க முடியும்.சூடாக்கிய பிறகு, சுருக்கமாக மையவிலக்கு செய்து, பிசிஆர் அமைப்பில் 1 μl சூப்பர்நேட்டன்ட்டை எதிர்வினை டெம்ப்ளேட்டாகச் சேர்க்கவும்.
அ.கத்தரிக்கோல் அல்லது பிற கருவிகள் பொருத்தமான அளவு மாதிரிகளை வெட்டுவதற்கு பயன்படுத்தப்படலாம்;பஞ்ச் அல்லது கத்தரிக்கோல் மீண்டும் பயன்படுத்தப்பட்டால், மாதிரிகள் இடையே குறுக்கு மாசுபடுவதைத் தடுக்க ஒவ்வொரு பயன்பாட்டிற்கும் முன்பு 2% சோடியம் ஹைபோகுளோரைட் கரைசலைக் கொண்டு சுத்தம் செய்ய வேண்டும்.
பி.பயன்பாட்டிற்கு முன் தாவர நேரடி லைசிஸ் பஃபர் முழுமையாக உருகியிருப்பதை உறுதி செய்யவும்.இடையகமானது பிசுபிசுப்பானதாகவோ அல்லது வீழ்படிவாகவோ இருந்தால், அதை 37℃ வெப்பநிலையில் சூடாக்கி, பயன்படுத்துவதற்கு முன்பு அதை முழுமையாக உருக்கலாம்.
c.எதிர்வினை அமைப்பில் உள்ள டெம்ப்ளேட்டின் அளவை தாவரப் பொருட்களின் அளவு மற்றும் நீர்த்த சேர்க்கப்படும் அளவு வேறுபாட்டிற்கு ஏற்ப சரியான முறையில் சரிசெய்யலாம்.
தாவர நேரடி லிசிஸ் பஃபர்
இந்தத் தயாரிப்பில் உள்ள பிளாண்ட் டைரக்ட் லைசிஸ் பஃபர் ஏ, பெரும்பாலான தாவர திசுக்களின் மரபணுவை வெளியிடுவதற்கு கண்டிப்பாக உகந்ததாக்கப்பட்டுள்ளது மற்றும் கச்சா தாவரங்களை 4℃ இல் குறுகிய கால சேமிப்பிற்கு ஏற்றது.மாதிரியை நீண்ட காலத்திற்கு (எ.கா., 1 – 2 மாதங்கள்) சேமித்து வைக்க வேண்டும் என்றால், சூப்பர்நேட்டன்ட்டை ஒரு புதிய EP குழாய்க்கு மாற்றி -20℃ இல் சேமிக்க பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.மாதிரிகளை இன்னும் நிலையாக சேமிக்க, மாற்றப்பட்ட சூப்பர்நேட்டண்டில் சம அளவு தாவர நேரடி லைசிஸ் பஃபர் B ஐச் சேர்த்து, நன்கு கலந்து -20℃ இல் சேமிக்கவும்.நிலையான சேமிப்பு நேரம் தாவர மாதிரிகள் மற்றும் மாநிலங்களைப் பொறுத்து மாறுபடும்.
எதிர்வினை அமைப்பு
| ddH2O | 20.0 μl வரை | 50.0 μl வரை |
| 2 × தாவர நேரடி மாஸ்டர் கலவைa | 10.0 μl | 25.0 µ |
| ப்ரைமர் 1 (10 µM) | 0.8 μl | 2.0 μl |
| ப்ரைமர் 2 (10 μM)b | 0.8 μl | 2.0 μl |
| தாவர இலை/கச்சா சாறு மாதிரி(மாதிரி செயலாக்கத்தைப் பார்க்கவும்) | 0.5 - 3 மிமீ இலை வட்டு/x µl | 0.5 - 3 மிமீ இலை வட்டு/x µl |
அ.இதில் Mg உள்ளது2+2 மிமீ இறுதி செறிவில்.
பி.ஒவ்வொரு ப்ரைமருக்கும் இறுதி செறிவு 0.4μM பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.ப்ரைமர்களை அதிகமாகப் பயன்படுத்துவது, குறிப்பிடப்படாத பெருக்கத்திற்கு வழிவகுக்கும்.
c.பயன்படுத்தப்படும் மாதிரியின் அளவை உண்மையான சூழ்நிலைக்கு ஏற்ப சரிசெய்யலாம்.கச்சா லைஸ் செய்யப்பட்ட மாதிரியின் ஒரு வினையில் பயன்படுத்தப்படும் அளவு, எதிர்வினையின் மொத்த அளவின் 2% - 20% இடையே சரிசெய்யப்படலாம்.அதிகப்படியான மாதிரிகளைப் பயன்படுத்துவது பெருக்கத் தோல்வியை ஏற்படுத்தும்.
எதிர்வினை திட்டம்
| படிகள் | வெப்ப நிலை | நேரம் |
| ஆரம்ப நிலைமாற்றம் | 98℃ | 5 நிமிடம் |
| டினாடரேஷன் | 95℃ | 10 நொடி |
| அனீலிங் | 58 ~ 72℃ | 15 நொடி |
| நீட்டிப்பு | 72℃ | 30 நொடி |
| இறுதி நீட்டிப்பு | 72℃ | 5 நிமிடம் |
அ.ஆரம்பக் குறைப்பு (98℃, 5 நிமிடம்) தாவர திசுக்களின் சிதைவை ஊக்குவிக்கிறது, PCR பெருக்கத்திற்குப் பயன்படுத்தக்கூடிய மரபணு DNA ஐ வெளியிடுகிறது.நேரத்தை குறைக்கவோ அல்லது வெப்பநிலையை குறைக்கவோ கூடாது.
பி.ப்ரைமர் Tm மதிப்புக்கு சமமாக அல்லது Tm மதிப்பை விட 2 ~ 4℃ அதிகமாக அமைக்க பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.இந்த தயாரிப்பில் பயன்படுத்தப்படும் நேரடி பெருக்க டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் வழக்கமான டாக் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸிலிருந்து வேறுபட்டது, மேலும் எதிர்வினை அனீலிங் வெப்பநிலைக்கான சிறப்புத் தேவைகள் உள்ளன; அதிக அனீலிங் வெப்பநிலையின் பயன்பாடு குறிப்பிடப்படாத பெருக்கத்தைக் குறைக்கலாம் மற்றும் பெருக்க செயல்திறனை மேம்படுத்தலாம்.சிக்கலான வார்ப்புருக்களுக்கு, அனீலிங் வெப்பநிலையை சரிசெய்தல் மற்றும் நீட்டிப்பு நேரத்தை நீட்டிப்பதன் மூலம் திறமையான பெருக்கத்தை அடைய முடியும்.
c.பெருக்கத் தயாரிப்பின் நீளம் ≤1 kb எனில், நீட்டிப்பு நேரம் 30 நொடி/kb என அமைக்கப்படும்;பெருக்கத் தயாரிப்பின் நீளம் >1 kb எனில், நீட்டிப்பு நேரம் 60 நொடி/kb என அமைக்கப்படும்.
ஈ.சிக்கலான மாதிரிகள் அல்லது குறைந்த பெருக்க மகசூல் கொண்ட மாதிரிகளுக்கு, சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கையை 40 -50 சுழற்சிகளுக்கு ஏற்றவாறு அதிகரிக்கலாம்.
விண்ணப்பங்கள்
தாவர திசுக்களின் நேரடி பெருக்கத்திற்கும், பாலிசாக்கரைடுகள் மற்றும் பாலிபினால்கள் இல்லாத தாவர மாதிரிகளின் உயர்-செயல்திறன் திரையிடலுக்கும் இது பொருந்தும்.
குறிப்புகள்
ஆராய்ச்சி பயன்பாட்டிற்கு மட்டுமே.நோயறிதல் நடைமுறைகளில் பயன்படுத்தப்படவில்லை.
1. கச்சா ஆலை பெருக்கம் அல்லது நேரடி பெருக்கத்திற்கு, சிஸ்டம், ப்ரைமர்கள் மற்றும் செயல்பாடுகள் சரியாக இருப்பதை உறுதிசெய்ய, பரிசோதனையைத் தொடங்குவதற்கு முன், சுத்திகரிக்கப்பட்ட மரபணு டிஎன்ஏவை நேர்மறையான கட்டுப்பாட்டாகப் பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.
2. இந்தக் கருவியில் பயன்படுத்தப்படும் நேரடி பெருக்க டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் வலுவான சரிபார்ப்பு செயல்பாட்டைக் கொண்டுள்ளது.டிஏ குளோனிங் செய்ய வேண்டியிருந்தால், அடினினைச் சேர்ப்பதற்கு முன் டிஎன்ஏவை சுத்திகரிக்க பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.
3. ப்ரைமர் வடிவமைப்பு வழிகாட்டுதல்:
அ.ப்ரைமரின் 3′ முடிவில் கடைசி அடிப்பாகம் G அல்லது C ஆக இருக்க வேண்டும் என்று பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.
பி.ப்ரைமரின் 3′ முடிவில் உள்ள கடைசி 8 தளங்களில் தொடர்ச்சியாக பொருந்தாதவை தவிர்க்கப்பட வேண்டும்.c.ப்ரைமரின் 3′ முடிவில் ஹேர்பின் அமைப்புகளைத் தவிர்க்கவும்.
ஈ.ஃபார்வர்டு ப்ரைமர் மற்றும் ரிவர்ஸ் ப்ரைமரின் Tm மதிப்பில் உள்ள வேறுபாடுகள் 1℃க்கு மிகாமல் இருக்க வேண்டும் மற்றும் Tm மதிப்பை 60 ~ 72℃ ஆக சரிசெய்ய வேண்டும் (Tm மதிப்பைக் கணக்கிட ப்ரைமர் பிரீமியர் 5 பரிந்துரைக்கப்படுகிறது).
இ.ப்ரைமர் டிஎம் மதிப்பைக் கணக்கிடும் போது டெம்ப்ளேட்டுடன் பொருந்தாத கூடுதல் கூடுதல் ப்ரைமர் சீக்வென்ஸ்கள் சேர்க்கப்படக்கூடாது.
f.ப்ரைமரின் GC உள்ளடக்கம் 40% -60% ஆக இருக்க பரிந்துரைக்கப்படுகிறது.
g.ப்ரைமரில் ஏ, ஜி, சி மற்றும் டி ஆகியவற்றின் ஒட்டுமொத்த விநியோகம் முடிந்தவரை சமமாக இருக்க வேண்டும்.அதிக GC அல்லது AT உள்ளடக்கங்களைக் கொண்ட பகுதிகளைப் பயன்படுத்துவதைத் தவிர்க்கவும்.
ம.ப்ரைமருக்குள் அல்லது இரண்டு ப்ரைமர்களுக்கு இடையில் 5 அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட தளங்களின் நிரப்பு வரிசைகள் இருப்பதைத் தவிர்க்கவும் மற்றும் இரண்டு ப்ரைமர்களின் 3′ முடிவில் 3 அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட தளங்களின் நிரப்பு வரிசைகள் இருப்பதைத் தவிர்க்கவும்.
நான்.குறிப்பிடப்படாத பெருக்கத்தைத் தடுக்க, ப்ரைமரின் தனித்தன்மையை சரிபார்க்க NCBI BLAST செயல்பாட்டைப் பயன்படுத்தவும்.
