புரோட்டீனேஸ் K mNGS (திரவம்)
புரோட்டினேஸ் கே என்பது ஒரு நிலையான செரின் புரோட்டீஸ் ஆகும், இது பரந்த அடி மூலக்கூறு விவரக்குறிப்பாகும்.இது சவர்க்காரங்களின் முன்னிலையில் கூட சொந்த மாநிலத்தில் பல புரதங்களை சிதைக்கிறது.படிக மற்றும் மூலக்கூறு அமைப்பு ஆய்வுகளின் சான்றுகள், என்சைம் செயலில் உள்ள வினையூக்கி முக்கோணத்துடன் (Asp) சப்டிலிசின் குடும்பத்தைச் சேர்ந்தது என்பதைக் குறிக்கிறது.39-அவருடைய69-சேர்224)தடுக்கப்பட்ட ஆல்பா அமினோ குழுக்களுடன் அலிபாடிக் மற்றும் நறுமண அமினோ அமிலங்களின் கார்பாக்சைல் குழுவிற்கு அருகில் உள்ள பெப்டைட் பிணைப்பு பிளவுகளின் முக்கிய தளமாகும்.இது பொதுவாக அதன் பரந்த தனித்தன்மைக்கு பயன்படுத்தப்படுகிறது.இந்த புரோட்டினேஸ் K சிறப்பாக mNGSக்காக வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளது.மற்ற புரோட்டினேஸ் K உடன் ஒப்பிடும்போது, இது அதே நொதி செயல்திறன் கொண்ட குறைவான நியூக்ளிக் அமில மாசுபாட்டைக் கொண்டுள்ளது, இது கீழ்நிலை mNGS பயன்பாட்டை சிறப்பாக உறுதிசெய்யும்.
களஞ்சிய நிலைமை
2 ஆண்டுகளுக்கு 2-8℃
விவரக்குறிப்பு
| தோற்றம் | நிறமற்ற முதல் வெளிர் பழுப்பு திரவம் |
| செயல்பாடு | ≥800 யூ/மிலி |
| புரதச் செறிவு | ≥20 மி.கி./மி.லி |
| நிக்கேஸ் | எதுவும் கண்டறியப்படவில்லை |
| DNase | எதுவும் கண்டறியப்படவில்லை |
| RNase | எதுவும் கண்டறியப்படவில்லை |
பண்புகள்
| EC எண் | 3.4.21.64(டிரிடிராச்சியம் ஆல்பத்திலிருந்து மறுசீரமைப்பு) |
| ஐசோ எலக்ட்ரிக் புள்ளி | 7.81 |
| உகந்த pH | 7.0- 12.0 படம் 1 |
| உகந்த வெப்பநிலை | 65℃ படம் 2 |
| pH நிலைத்தன்மை | pH 4.5- 12.5 (25 ℃, 16 h) படம் 3 |
| வெப்ப நிலைத்தன்மை | 50 ℃ க்கு கீழே (pH 8.0, 30 நிமிடம்) படம் 4 |
| சேமிப்பக நிலைத்தன்மை | 25 ℃ இல் 12 மாதங்களுக்கு 90% க்கும் அதிகமான செயல்பாடு |
| ஆக்டிவேட்டர்கள் | எஸ்டிஎஸ், யூரியா |
| தடுப்பான்கள் | டைசோபிரைல் ஃப்ளோரோபாஸ்பேட்;ஃபீனில்மெதில்சல்போனைல் புளோரைடு |
விண்ணப்பங்கள்
1. மரபணு கண்டறியும் கருவி
2. RNA மற்றும் DNA பிரித்தெடுக்கும் கருவிகள்
3. திசுக்களில் இருந்து புரதம் அல்லாத கூறுகளை பிரித்தெடுத்தல், டிஎன்ஏ போன்ற புரத அசுத்தங்களின் சிதைவுதடுப்பூசிகள் மற்றும் ஹெபரின் தயாரித்தல்
4. பல்ஸ்டு எலக்ட்ரோபோரேசிஸ் மூலம் குரோமோசோம் டிஎன்ஏ தயாரித்தல்
5. வெஸ்டர்ன் பிளட்
6. விட்ரோ நோயறிதலில் என்சைமடிக் கிளைகோசைலேட்டட் அல்புமின் எதிர்வினைகள்
தற்காப்பு நடவடிக்கைகள்
பயன்படுத்தும் போது அல்லது எடைபோடும் போது பாதுகாப்பு கையுறைகள் மற்றும் கண்ணாடிகளை அணியவும், பயன்படுத்திய பிறகு நன்கு காற்றோட்டமாக வைக்கவும்.இந்த தயாரிப்பு தோல் ஒவ்வாமை மற்றும் கடுமையான கண் எரிச்சலை ஏற்படுத்தும்.உள்ளிழுத்தால், அது ஒவ்வாமை அல்லது ஆஸ்துமா அறிகுறிகள் அல்லது மூச்சுத்திணறல் ஏற்படலாம்.சுவாச எரிச்சல் ஏற்படலாம்.
அலகு வரையறை
ஒரு அலகு (U) என்பது 1 μmol ஐ உற்பத்தி செய்ய கேசீனை ஹைட்ரோலைஸ் செய்ய தேவையான நொதியின் அளவு என வரையறுக்கப்படுகிறது.பின்வரும் நிபந்தனைகளின் கீழ் நிமிடத்திற்கு டைரோசின்.
எதிர்வினைகள் தயாரிப்பு
மறுஉருவாக்கம் I: 1 கிராம் பால் கேசீன் 50 மில்லி 0.1M சோடியம் பாஸ்பேட் கரைசலில் (pH 8.0) கரைக்கப்பட்டது, 65-70 ℃ தண்ணீரில் 15 நிமிடங்களுக்கு அடைகாத்து, கிளறி மற்றும் கரைத்து, தண்ணீரால் குளிரூட்டப்பட்டு, சோடியம் ஹைட்ராக்சைடால் pH 8.0 க்கு சரி செய்யப்பட்டது. 100மிலி
மறுஉருவாக்கம் II: 0.1M ட்ரைக்ளோரோஅசிட்டிக் அமிலம், 0.2M சோடியம் அசிடேட், 0.3M அசிட்டிக் அமிலம்.
ரீஜென்ட் III: 0.4M Na2CO3தீர்வு.
மறுஉருவாக்கம் IV: ஃபோரின்ட் ரீஜென்ட் தூய நீரில் 5 முறை நீர்த்தப்படுகிறது.
ரீஜென்ட் V: என்சைம் நீர்த்த: 0.1M சோடியம் பாஸ்பேட் கரைசல் (pH 8.0).
ரீஜென்ட் VI: டைரோசின் கரைசல்: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml டைரோசின் 0.2 உடன் கரைக்கப்பட்டதுஎம் எச்.சி.எல்.
செயல்முறை
1. 0.5ml ரீஜென்ட் I 37℃ க்கு முன் சூடேற்றப்பட்டு, 0.5ml நொதி கரைசலை சேர்த்து, நன்கு கலந்து, அடைகாக்கும்10 நிமிடங்களுக்கு 37℃.
2. எதிர்வினையை நிறுத்த 1ml வினைப்பொருள் II ஐச் சேர்த்து, நன்கு கலந்து, 30 நிமிடங்களுக்கு அடைகாப்பதைத் தொடரவும்.
3. மையவிலக்கு எதிர்வினை தீர்வு.
4. 0.5ml சூப்பர்நேட்டன்ட் எடுத்து, 2.5ml reagent III, 0.5ml reagent IV சேர்த்து, நன்கு கலந்து 37℃ இல் அடைகாக்கவும்.30 நிமிடங்களுக்கு.
5. OD660OD என தீர்மானிக்கப்பட்டது1;வெற்றுக் கட்டுப்பாட்டுக் குழு: நொதிக்குப் பதிலாக 0.5மிலி ரியாஜென்ட் V பயன்படுத்தப்படுகிறதுOD ஐ தீர்மானிக்க தீர்வு660OD ஆக2, ΔOD=OD1-ஓ.டி2.
6. எல்-டைரோசின் நிலையான வளைவு: 0.5mL வெவ்வேறு செறிவு L-டைரோசின் கரைசல், 2.5mL ரீஜென்ட் III, 5mL மையவிலக்குக் குழாயில் 0.5mL ரீஜென்ட் IV, 30 நிமிடங்களுக்கு 37℃ இல் அடைகாத்து, OD க்கான கண்டறிய660எல்-டைரோசினின் வெவ்வேறு செறிவுக்கு, பின்னர் நிலையான வளைவு Y=kX+b பெறப்பட்டது, இங்கு Y என்பது L-டைரோசின் செறிவு, X என்பது OD600.
கணக்கீடு
2: எதிர்வினை கரைசலின் மொத்த அளவு (mL)
0.5: என்சைம் கரைசலின் அளவு (mL)
0.5: குரோமோஜெனிக் தீர்மானத்தில் (mL) பயன்படுத்தப்படும் எதிர்வினை திரவ அளவு
10: எதிர்வினை நேரம் (நிமிடம்)
Df: நீர்த்தல் பல
C: என்சைம் செறிவு (mg/mL)
குறிப்புகள்
1. Wieger U & Hilz H. FEBS லெட்.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.உயிரியல்.ரெஸ்.கம்யூனிஸ்ட்.(1971);44:513.
3. ஹில்ஸ், எச்.மற்றும் பலர்.,யூரோ.ஜே. பயோகெம்.(1975);56:103–108.
4. சம்ப்ரூக் ஜேet அல்., மூலக்கூறு குளோனிங்: ஒரு ஆய்வக கையேடு, 2வது பதிப்பு, குளிர் வசந்த துறைமுகம்ஆய்வக அச்சகம், குளிர் வசந்த துறைமுகம் (1989).
புள்ளிவிவரங்கள்
படம்.1 உகந்தது pH
100mM தாங்கல் தீர்வு:pH6.0-8.0, Na-பாஸ்பேட்;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, கிளைசின்-NaOH.என்சைம் செறிவு:1mg/mL
படம்.2 உகந்த வெப்பநிலை
20 mM K-பாஸ்பேட் பஃபர் pH 8.0 இல் எதிர்வினை.என்சைம் செறிவு: 1 mg/mL
படம்.3 pH ஸ்திரத்தன்மை
25 ℃, 50 mM தாங்கல் தீர்வுடன் 16 h-சிகிச்சை: pH 4.5- 5.5, அசிடேட்;pH 6.0-8.0, நா-பாஸ்பேட்;pH 8.0-9.0, டிரிஸ்-HCl.pH 9.0- 12.5, கிளைசின்-NaOH.என்சைம் செறிவு: 1 mg/mL
படம்.4 வெப்ப ஸ்திரத்தன்மை
50 mM Tris-HCl இடையகத்துடன் 30 நிமிட சிகிச்சை, pH 8.0.என்சைம் செறிவு: 1 mg/mL
படம்.5 சேமிப்பு நிலைத்தன்மைty at 25℃
